Se demostrará en seguida el uso del programa de planilla electrónica Microsoft Excel 5.0 para Windows en la implementación de la sistemática de cálculo para la determinación de una curva de calibración. Los datos de este ejemplo (Tabla 1) provienen de experimentos con un Cromatógrafo a Gás con Detector por Emisión Atómica en Plasma de Hélio Inducido por Microondas (CG-PIM) [10], y refiérense a áreas de picos cromatográficos de n-decano. En Cromatografia a Gás, las curvas de calibración correlacionan el área de los picos con la masa de substancia eluída que llega al detector. Sin embargo, el procedimiento adoptado en este ejemplo es válido para cualquier curva de calibración lineal.

Tabla 1 - área A de los Picos Cromatográficos, en unidades, en función de las masas de n-decano (en ng) para un sistema CG-PIM.

Para la construcción de la curva de calibración (A = am + b) los datos listados deben ser inicialmente inseridos en una planilla de cálculos vacía. La Figura 3 contiene el aspecto de la planilla después de inseridos los datos. Las masas han sido puestas en la columna A de la planilla, en el conjunto de celdas de A3 a A10, y las áreas correspondientes en la columna B, en el conjunto de celdas de B3 a B10. Fíjese que en las celdas A2 y B2 fueron digitadas leyendas para las columnas de datos correspondientes. Aunque no sea estrictamente necesaria para los cálculos subsecuentes, se recomienda esta operación para tornar más clara y comprehensible la planilla en construcción.

Después de la entrada de los datos, el paso siguiente es una inspección visual, a través de un gráfico de área x Masa, construído en la misma planilla. En esta primera verificación, se pueden detectar los posibles puntos discrepantes ("outliers") del conjunto, además de hacerse una evaluación inicial de la linealidad de la curva. La Figura 4 contiene el gráfico de área x Masa, construído por la planilla con los datos anteriores.

Queda claro en esta primera evaluación que el área no varía linealmente con la masa en todo el rango definido por los datos. Como visiblemente los últimos puntos no se comportan linealmente, algunos datos deben de ser rechazados.

Tutorial

[1] A través del gráfico de área x Masa construído, verificar cuales puntos del conjunto pueden, con cierta seguridad, ser incluídos en el rango lineal. Por la Figura 4, se percibe que la curva es aparentemente lineal hasta el cuarto par de puntos área-masa (A = 521607 unidades; m = 22,66 ng).

[2]Estímanse los coeficientes de regresión para una recta cubriendo este rango seleccionado de puntos. La sintaxis de las fórmulas para cálculo de los coeficientes angular a, lineal b y de correlación r (o r²), en las versiones en inglés del programa de planillas Excel es:

- coeficiente angular: =SLOPE (Valores de Y; valores de X);

- coeficiente lineal: =INTERCEPT (Valores de Y; valores de X) y

- coeficiente de correlación: =CORREL (Valores de Y; valores de X) donde Valores de Y y Valores de X refiérense, respectivamente, al conjunto de celdas que contienen las áreas y las masas. Para calcular los coeficientes de regresión para los cuatro primeros puntos experimentales (masa en las celdas A3 a A6 y áreas en las celdas B3 a B6), las fórmulas anteriores deben ser digitadas en celdas vacías de la planilla: =SLOPE (B3..B6;A3..A6); =INTERCEPT (B3..B6;A3..A6) y =CORREL (B3..B6;A3..A6). En este ejemplo, han sido utilizadas las celdas B13, B14 y B15 para contener estos coeficientes.

Observación: En las versiones en portugués del programa Excel, los equivalentes de las funciones mencionadas arriba son, respectivamente, =INCLINAÇÃO(...), =INTERCEPTAÇÃO(...) e =CORREL(...). La forma de uso y sintaxis de estas funciones es la misma de la versión en inglés.

[3] Calcúlanse las áreas interpoladas <A> usando los coeficientes de regresión estimados anteriormente para todos los valores experimentales diponibles. En la planilla, inicialmente se calcula <A> para el primer punto de la curva digitándose, en la celda vacía inmediatamente a la derecha de las usadas para los datos (C3), la fórmula =$B$13*A3+$B$14 ($B$13 = celda con el coeficiente angular a, $B$14 = coeficiente lineal b y A3 = masa para el primer punto). Para los demás puntos, se copia el contenido de la celda C3 para el conjunto de celdas C4 a C10. No olvidar que una celda cuyas direcciones son digitadas entre "$" (por ejemplo, $B$13) es asumida por la planilla como constante. Se puede entonces obtener la curva de calibración provisoria (Figura 5).

[4] Estímanse los resíduos de interpolación para todos los valores experimentales. En la celda a la derecha de la usada para el primer valor de <A> (D3), digítase =B3-C3, y se copia esta celda para el conjunto de celdas correspondiente a los demás valores (D4 a D10).

[5] Calcúlanse los cuocientes área / masa para todos los puntos experimentales: en la celda E3, calcúlase A/m para el primer punto, a través de =(B3-$B$14)/A3 y se copia para el conjunto de E4 a E10.

[6] Determínanse los límites inferior y superior de tolerancia para el cuociente A/m a través de las ecuaciones =0.95*$B$13 (límite inferior) y =1.05*$B$13 (límite superior). Aquí se han utilizado las celdas F13 y F14 para estas fórmulas, respectivamente. La Figura 6 contiene el aspecto de la planilla, después de la inserción de las fórmulas anteriores. También han sido inseridas, en celdas adecuadas, las leyendas para los valores calculados, conforme discutido anteriormente.

[7] Prepárase un histograma (gráfico de columnas) de los residuos de interpolación (calculados en el conjunto de celdas de D3 a D10). La Figura 7 exibe el gráfico para este ejemplo.

[8] Prepárase un gráfico de los cuocientes A/m (E3 a E10) y de los límites del rango de tolerancia (F13 y F14), en función de la masa (Figura 8).

[9] A través de estos dos gráficos, se verifica si existen más puntos que pueden ser adicionados o deben de ser excluídos de la recta. El cuociente A/m del quinto punto de la secuencia (A = 626827 unidades; m = 28,32 ng) se encuentra dentro del rango admitido por los límites de tolerancia calculados, lo que indica que este punto puede ser incluido en la recta. El histograma de los resíduos está de acuerdo con esta evaluación. Hasta este punto, la distribución de los resíduos tiende a ser aleatoria alrededor del cero, pero a partir del sexto punto los resíduos muestran claramente un estándar típico de no-linearidad.

[10] En el caso de que algún punto deba ser incluído o excluído del rango usado en los cálculos, editar las fórmulas de los coeficientes de regresión (celdas B13, B14 y B15), de manera que los conjuntos de celdas referidas en estas fórmulas incluyan (o excluyan) los puntos seleccionados en la etapa anterior. Por ejemplo, la celda B13, que contiene la fórmula =SLOPE (B3..B6;A3..A6) debe ser alterada para SLOPE (B3..B7;A3..A7), para incluir el quinto par área/masa (que está contenido en A7 a B7) en el cálculo del coeficiente angular.

Cuando alteradas las fórmulas de los coeficientes de regresión, la tabla de cálculos (Figura 9) otra vez calula automaticamente todos los valores que dependen de estos coeficientes: áreas interpoladas, resíduos, cuocientes área/masa y límites de tolerancia para A/m. Los gráficos de los resíduos de interpolación (Figura 10) y de los cuocientes A/m (Figura 11) también son corregidos para los nuevos valores, sin intervención del usuario.

[11] Se repite continuamente la evaluación hecha en [9] con los valores recalculados, hasta que ningún punto más deba ser inserido o excluído de los cálculos. En este ejemplo, después de la primera alteración (adición del quinto punto experimental a los cálculos), ningún valor más debe de ser incluído: los cuocientes A/m de los puntos #6 a #8 están bastante distantes del intervalo de tolerancia, y por el histograma de los resíduos se percibe una tendencia pronunciada a la no-linealidad a partir de estos puntos. De esta manera, la curva de calibración determinada ha sido A = 21730 m + 17413, con r = 0,9992, válida para las masas de n-decano entre 5,66 ng y 28,32 ng (Figura 12).