Um espectrofluorímetro é, em geral, composto por dois monocromadores , um de excitação e um de emissão, um sistema de excitação (que normalmente é uma lâmpada de mercúrio ou de xenônio) e um sistema de detecção (que normalmente é um tubo fotomultiplicador).

Um monocromador é composto por um arranjo óptico no qual uma fonte de luz policromática incidente se decompõe em seus diferentes comprimentos de onda através de uma grade de difração . Os comprimentos de onda para a excitação da amostra são selecionados pelo monocromador de excitação, e a radiação emitida é analisada pelo monocromador de emissão, sendo a intensidade da radiação emitida determinada pelo tubo fotomultiplicador. Esquemas e o princípio de funcionamento de um tubo fotomultiplicador podem ser encontrados em outros textos [2,3].

Fontes de radiação

Os espectrofluorímetros podem ter fontes de radiação diferentes, incluindo-se nos instrumentos mais sofisticados uma fonte do tipo laser [4]. Nos instrumentos comerciais mais comuns, entretanto, a fonte é uma lâmpada de emissão contínua, que pode ser de xenônio ou mercúrio. Pelos espectros de emissão de lâmpadas de xenônio e de mercúrio (Figura 1), pode-se observar que enquanto a lâmpada de xenônio emite praticamente em toda a região do espectro visível e ultravioleta (250 nm< < 800 nm - Figura 1c), a lâmpada de mercúrio emite, nesta mesma região, na forma de linhas (bandas com largura a meia altura bastante fina). A lâmpada de xenônio oferece, portanto, um maior número de comprimentos de onda possíveis para a excitação da amostra, enquanto que a lâmpada de mercúrio oferece maior intensidade nos comprimentos de onda em que emite. Assim, para selecionar entre uma ou outra lâmpada, o critério está na necessidade de se ter muitas linhas disponíveis ou se a condição necessária é a intensidade da linha, o que é importante quando a absorção da amostra é muito fraca.

Uma das vantagens de se trabalhar com a lâmpada de mercúrio é que a intensidade de emissão na região do ultravioleta é maior e, portanto, se a emissão da amostra se concentra nesta região do espectro, sua utilização é muitas vezes necessária. Ao se adquirir um espectrofluorímetro deve-se especificar que tipo de fonte se deseja, e na grande maioria dos casos é possível se dispor das duas fontes, sendo uma delas opcional. Deve-se notar, entretanto, que ao operar com uma ou com outra, deve-se efetuar ajustes específicos no instrumento, tendo em vista que elas operam com tensões diferentes nos eletrodos.

Normalmente estas lâmpadas são denominadas lâmpadas de alta pressão e arco curto, dispondo de dois eletrodos aos quais são aplicadas tensões produzindo uma descarga elétrica entre os mesmos. Esta descarga ioniza o gás, que passa a emitir radiação eletromagnética. . A tensão aplicada entre estes eletrodos depende do tipo de gás (xenônio, mercúrio, etc) e da potência da lâmpada. A Figura 2 mostra uma fotografia de uma lâmpada de mercúrio utilizada em alguns espectrofluorímetros. Outros instrumentos utilizam lâmpadas de marcas e modelos diferentes, mas a função e o princípio de funcionamento são os mesmos.

Esquema óptico

Um esquema típico de um espectrofluorímetro fotoestacionário está mostrado na Figura 3. Nesta se pode observar a presença dos dois monocromadores [2], o de excitação e o de emissão. A emissão da lâmpada é focalizada na entrada do monocromador de excitação, sendo que este possui uma grade de difração que será posicionada de modo a incidir o comprimento de onda selecionado sobre a fenda do monocromador de emissão. Este monocromador de excitação tem, portanto, a finalidade de permitir a seleção do comprimento de onda que será utilizado para a excitação da amostra. O critério para esta seleção é que este comprimento de onda corresponda ao máximo de absorção da transição de menor energia da espécie em estudo. Assim, a radiação no comprimento de onda selecionado ao incidir sobre a amostra irá excitá-la a um estado eletrônico de alta energia e esta irá emitir de acordo com os seus processos fotofísicos característicos.

A radiação selecionada entra no compartimento da amostra, que contém, além do porta-amostra, um detector de referência. Este é um outro detalhe importante dos espectrofluorímetros, quando comparados com os espectrofotômetros de absorção [2], que normalmente não tem esta fotomultiplicadora adicional, denominada de referência.
Nos espectrofotômetros de absorção de duplo feixe, o sinal da amostra e o da referência são medidos na mesma fotomultiplicadora e analisados por um circuito eletrônico, de modo que qualquer oscilação de intensidade da lâmpada seja automaticamente compensada [2]. No caso do espectrofluorímetro, uma flutuação de sinal da fonte de excitação também deve levar a uma flutuação no sinal da emissão, mas como o que se está medindo são sinais de origens diferentes, os mesmos são medidos por fotomultiplicadoras diferentes.

Então, enquanto a fotomultiplicadora de referência mede a intensidade de emissão da lâmpada espalhada pela amostra, a outra fotomultiplicadora detecta o sinal da emissão da amostra. Se houver qualquer oscilação de sinal, a fotomultiplicadora de referência envia ao circuito eletrônico de detecção esta informação e este circuito compensa eletronicamente esta diferença de sinal. A fotomultiplicadora que mede o sinal de emissão está colocada na saída do correspondente monocromador. Da mesma forma que o monocromador de excitação, o de emissão também dispõe de uma grade para selecionar cada comprimento de onda do espectro de emissão, que terá sua intensidade determinada pela fotomultiplicadora de emissão.

A radiação emitida é focalizada na entrada do monocromador de emissão, em um ângulo de 90° em relação à radiação incidente. Note que esta geometria é diferente daquela de um espectrofotômetro de absorção, no qual a luz emergente da amostra é levada ao detector em um ângulo de 180° [2]. Isto se deve ao fato de que a intensidade de emissão é muito menor do que a intensidade da radiação de excitação, e conseqüentemente o sinal de emissão, se analisado na mesma direção da excitação, ficaria mascarado.

A necessidade de se medir a emissão neste ângulo de 90° em relação ao feixe de excitação exige que as cubetas para espectroscopia de fluorescência tenham todas as suas quatro faces polidas, e não apenas duas faces paralelas, como aquelas comumente utilizadas em espectroscopia eletrônica de absorção. Isto implica que o custo das cubetas para espectroscopia de fluorescência é muito maior do que para espectroscopia de absorção. Tipos diferentes de cubetas podem ser encontradas no mercado, para suprir necessidades também diferentes. As mais comuns são as de 10 mm de caminho óptico, mas podem ser encontradas cubetas com vários comprimentos de caminhos ópticos, além de cubetas triangulares, para fluxo, suportes para sólidos, etc.